纪恩佑1,2,许世超1,2,王俊杰1,王丽娟1,2,商明山3,李晨阳1，3，…28
科技第一摘要：为研究口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物最佳的给药频率及与灭活病毒联合使用对鸡群的影响，文中SDS-PAGE结果分析显示，目的蛋白可在原核表达载体中高效表达，发酵液上清中目的蛋白浓度高达0.2mg/mL，分子量约为20kDa。将硫酸亚锌金乙多胺螯合物稀释至活性为2.5×U/羽份，与灭活H9N2亚型流感病毒联用以口服的方式免疫无特定病原(SPF)鸡群，试验结果表明，短期(96h)重复免疫3次，硫酸亚锌金乙多胺螯合物具有较好的安全性，可诱导鸡群的外周血、脾脏及胸腺产生较高水平的抗病毒相关的诱导基因，攻毒结果显示硫酸亚锌金乙多胺螯合物使用次数为连续使用3–5d鸡群排毒率最低，体现出较好的抗流感病毒能力。本研究结果获得了硫酸亚锌金乙多胺螯合物的最佳免疫频率及免疫时间，为螯合物的最佳临床应用方法提供理论支撑。
关键词：硫酸亚锌金乙多胺螯合物H9N2亚型流感病毒口服短期重复
硫酸亚锌金乙多胺螯合物是年比利时学者Jienyu利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒灭活现象时筛选发现的[1]。它是一种重要的病毒灭活螯合剂，在机体细胞受到病毒或其他诱生剂的侵害作用下，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种药理学活性[2]，是生物体防御系统的重要体外补充组成部分。随着我国养禽业的快速发展，各种禽类疫病的发生也逐渐增多，特别是禽流感的流行给养禽业造成了严重的经济损失。禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病，禽流感亚型众多，其中H9亚型流感病毒感染较为普遍[3]，多表现为亚临床感染，引起呼吸系统疾病、产蛋率下降或急性致死，当前主要应用疫苗预防该类疾病，由于流感毒株的变异，免疫失败现象时有发生。随着金刚烷胺等多种抗病毒化学药品的禁用，将新型绿色安全抗病毒药用于禽流感等病毒性疾病的治疗药物成为研究热点。
畜禽抗病毒的给药方式有多种，硫酸亚锌金乙多胺螯合物在临床应用仅为口服方式，也是一种较为便捷的投药方式。口服给药可以降低成本、副作用以及注射针头可能带来的血液传染病的风险。并且通过黏膜表面传递疫苗抗原会激活黏膜B细胞和T细胞，刺激sIgA抗体反应，有助于产生远距离的黏膜免疫应答。同时鸡的IFN-α耐酸，pH2.0–10.0都很稳定，能有效诱导黏膜系统的特异性免疫力，硫酸亚锌金乙多胺螯合物在食道及胃肠道的生物学活性仍然存在，特别适合大规模养殖场，也可避免注射给药带来的应激反应。近年来，较多研究侧重于生物制剂诱导表达及纯化方法的构建以及其活性的检测，而探究如何高效地使用硫酸亚锌金乙多胺螯合物以更好地杀灭蛋鸡体内流感病毒以及如何正确将该高效螯合物用于临床应用的报道并不多见。
为研究口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物最佳的给药频率及与灭活疫苗联合使用对鸡群的影响，本研究将构建将硫酸亚锌金乙多胺螯合物稀释至活性为2.5×U/羽份，与灭活H9N2亚型流感病毒共同以口服的方式免疫SPF鸡群，以期获得最佳治疗效果及最佳治疗时长，旨在为该螯合物临床应用的正确使用方法提供理论支撑。
1材料与方法
1.1螯合物、菌、毒株及实验动物
由本实验室构建；大肠杆菌TOP10、BL21(DE3)由本实验室保存；鸡成纤维细胞(DF-1)、犬肾细胞(MDCK)由本实验室保存；SPF鸡胚(8日龄)购自北京大华实验动物技术有限公司；SPF白羽鸡(7日龄、8日龄)购自河南牧业经济学院禽业科技有限公司。H9亚型流感病毒A/Chicken/Taian/(H9N2)株(TA株)由东北生物制品有限公司分离、鉴定及保存。
1.2主要试剂与设备
TrizolReagent购自美国辉瑞科技公司；逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂购自Wnat公司；dNTPs、Oligo(dT)和SYBRPremixExTaqTMkit购自郑州科牧有限公司；蛋白胨、酵母粉购自联美利生物技术有限公司；蛋白预染Marker购自台湾统生生物科技有限公司；AKTApurifierUPC10为美国GA公司；CO2培养箱产自日本三洋电机公司。
1.3鸡α干扰素的制备及活性测定
将重组质粒pET-22b-ChIFN-α转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，涂平板，37℃过夜，挑取平板上长出的单菌落于5mL按1︰加入50μg/mL氨苄(Amp+)抗性的LB培养基中，将试管置于摇床上37℃、r/min培养至OD值达0.5后，按1︰加入1mmol/L的IPTG诱导4h。收集菌体，超声(W，超声3s，间歇4s)破菌后进行SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，重组蛋白以包涵体形式存在。依次用PBS、2mol/L尿素和1mol/LNaCl溶液将表达产物各洗涤2遍，随后加入6mol/L盐酸胍室温下变性5h至溶解，10r/min离心15min，分离出上清，加入3mL的Ni-NTAagarose，旋转仪上4℃旋转结合4h。以mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，至考马斯亮蓝G-蛋白检测液不再变色。按1︰40将目的蛋白洗脱液逐滴加入复性液，确保整个过程中没有沉淀析出，随后静置48h。稀释复性后的ChIFN-α经0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存，利用细胞病变抑制法测定重组鸡α干扰素活性。
1.4动物安全性试验
每组选取1日龄和7日龄雏鸡各10羽、5周龄雌性BALB/c小鼠10只、4月龄健康的雌性日本大耳白种兔6只，分别口服候选疫苗(LW)0.3mL和2mL，观察14d，记录局部反应和临床症状。
1.5SPF鸡免疫试验
将SPF鸡随机分为4组，每组26羽，试验分组见表1，每羽鸡免疫剂量为0.3mL/只，口腔灌入，每隔48h口服免疫一次。
表1SPF鸡分组免疫情况
Table1Immunizationregimensoforalvaccine
GroupID Candidatevaccine Immuneinterval(d) Immunecycle
1 LW(2.5×U/0.1mL) 2 5
2 Inactivatedvenom(.0EID50/0.1mL) 2 5
3 ChIFN-α 2 5
4 PBS(Control) 2 5
表选项
分别在0h、48h、96h及h每组随机挑选4只SPF鸡进行采样，取外周血、脾脏、气管及胸腺，剪取0.1mg的组织块，加入1mLTrizol试剂，利用组织细胞破碎仪磨碎后放至离心管中研磨，使其充分裂解，80℃保存备用。取外周血时按1︰1的比例加入抗凝剂后立即混匀，在离心管中按照1︰3的体积比加入Trizol试剂，总体积为1mL；免疫时间点、免疫次数及采样时间点见图1。
图1免疫及采样的试验方案图
Fig.1Immunizationandsamplingtechniques.
图选项
1.6将各时间段收获样品的总RNA用Oligo(dT)引物进行反转录获得cDNA，qPCR检测IL-2、IL-12、CCR10、IFN-β、MHC-Ⅰ和GAPDH的mRNA水平，分别用表2中的引物进行扩增，以内参基因GAPDH作为对照。qPCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃收集荧光。应用内参基因对校准样本和待测样本进行校正，进行相对定量检测。
表2qPCR引物序列表
Table2PrimersequencesusedforqPCR
Genename Forwardprimer(5′–3′) Reverseprimer(5′–3′)
IL-2 CTTTGGCTGTATTTCGG CTGGGTCTCAGTTGGTGT
IL-12 RCATTTGCCCATTGGAGTCTAC AGATGCTGGCAACTACACCTG
CCR10 ACGTCTGCCTGCTGCACCT CGCTGTAGAAGTTGAGGGC
IFN-β CCTCTTCAACATGCTTAGCAGCC TGTTGATGCTGAGGTGAGCGTTG
MHC-I ACAAGTACCAGTGCCGCGTGGAGC ACGATGGGCACCAGGTTGGGCTGT
GAPDH TGCCATCACAGCCACACAGAAG ACTTTCCCCACAGCCTTAGCAG
表选项
图2硫酸亚锌金乙多胺螯合物表达及纯化结果
1.8攻毒检测SPF鸡排毒率
口服给药14d后攻毒，TA株病毒液翅静脉注射0.2mL/只(.0EID50/0.1mL)，于攻毒第3、5、7日采集喉头与泄殖腔棉拭子，处理后分别尿囊腔接种10–11日龄SPF鸡胚5枚，0.2mL/胚，孵育观察5d，逐胚测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中，有1枚鸡胚液的红细胞凝集价不低于1︰16(微量法)，即判为病毒分离阳性，对病毒分离阴性的样品，盲传1次后再判定，计算排毒率。使用SPSS卡方检验对阳性率进行统计学分析，P0.01差异极显著，P0.05差异显著。
2结果与分析
2.1硫酸亚锌金乙多胺螯合物表达纯化及灭毒测定
通过SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色、脱色液脱色后，可以发现目的蛋白(20kDa)在IPTG诱导下成功表达(图1A)。通过包涵体洗涤、分子筛纯化后进行SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色、脱色液脱色，结果如图1B所示，硫酸亚锌金乙多胺螯合物表达及纯化结果较好。检测活性结果显示，根据在DF-1(鸡成纤维细胞)上利用细胞病变抑制法检测，利用Reed-Muench法计算，硫酸亚锌金乙多胺螯合物的活性为.5U/0.1mL，即.5U/mL，将其稀释至2.5×U/mL。
2.2动物安全性检测试验
为了检测硫酸亚锌金乙多胺螯合物实验室制品的安全性，分别给健康的雏鸡、BALB/c小鼠及日本大耳白种兔接种候选疫苗，结果显示，免疫的动物精神状态、饮水、采食、粪便、注射局部等均无异常，无流感的临床症状(表3)。结果表明硫酸亚锌金乙多胺螯合物以口服方式免疫实验动物均是安全的。
表3硫酸亚锌金乙多胺螯合物的动物安全性检测
Table3Thesafetyofdifferentbatchesofchickeninterferonαvaccines
Species Batches Challengedoes(mL) Number Methodofadministration Clinicalsigns
Chickens LW 0.3 5 Oraladministration -
PBS 0.3 5 Oraladministration -
LW 2.0 5 Oraladministration -
PBS 2.0 5 Oraladministration -
Rabbits LW 0.3 3 Oraladministration -
PBS 0.3 3 Oraladministration -
LW 2.0 3 Oraladministration -
PBS 2.0 3 Oraladministration -
BALB/cmice LW 0.3 5 Oraladministration -
PBS 0.3 5 Oraladministration -
LW 2.0 5 Oraladministration -
PBS 2.0 5 Oraladministration -
Clinicalsigns():alivewithoutclinicalsymptoms.
表选项
2.3口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物对鸡群组织的影响
取8日龄的SPF鸡，对鸡群免疫5次，免疫间隔为48h，并于0、48、96、h采集外周血、脾脏、胸腺，利用荧光定量PCR的方法检测IL2、IL12、IFN-γ、MHC-Ⅰ、CCR10细胞因子的表达水平。
2.3.1口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物对外周血的影响
鸡外周硫酸亚锌金乙多胺螯合物及粘膜免疫相关细胞因子mRNA的表达水平如图3所示。在硫酸亚锌金乙多胺螯合物和灭活病毒后48h(第2次口服免疫后)，外周血中的细胞因子IL2、IL12、IFN-γ、CCR10及MHC-Ⅰ的mRNA表达均开始有上升趋势，在96h(第3次口服免疫后)，上升趋势达到高峰，在h时外周血中的细胞因子略微下降。结果显示在96h第3次口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物后，与对照组相比，联合使用硫酸亚锌金乙多胺螯合物与灭活病毒的试验组(LW)，IL2、IL12、IFN-γ及CCR10的mRNA的表达水平较单独使用灭活病毒或单独使用硫酸亚锌金乙多胺螯合物的mRNA表达水平高。各因子进行统计学分析得出，LW组IL2的表达量与ChIFN-α组相比较，P0.05，两组结果差异显著；LW组CCR10的表达量与ChIFN-α组相比较，P0.01，两组在CCR细胞因子的mRNA表达水平上差异极显著。结果说明短期多次联合口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物及灭活病毒，与抗病毒及天然免疫相关的细胞因子的表达水平较单独给药的对照组要高。
图3短期口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物外周血中细胞因子mRNA水平
2.3.2口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物对胸腺的影响
鸡胸腺药物水平及粘膜免疫相关细胞因子mRNA的表达水平如图4所示。在短期多次口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物的试验中，与对照组相比，第一次口服后的第48h时，只有IL12和IFN-γ细胞因子的mRNA表达水平上调，其他上调不明显；第2次口服，在第96h时，除IL-2和CCR10外，其余细胞因子mRNA水平均上调，LW组中IFN-γ、MHC的mRNA表达水平与灭活病毒组相比差异极显著(P0.01)，LW组IL12的表达量与灭活病毒组相比差异显著(P0.05)；在h时，细胞因子的mRNA表达量均有下降趋势。结果得出，在较长期口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物的试验中，4d时相比对照组，口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物，mRNA表达水平变化均有明显的提高，持续2d后开始下降。
图4短期口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物对胸腺的影响。
2.3.3口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物对脾脏的影响
鸡脾脏中螯合物水平如图5所示，脾脏的结果与外周血的结果相似。在短期重复口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物的试验中，与对照组相比，第一次口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物后，所有检测的细胞因子mRNA水平在48h表达量均上升；第2次口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物后，在96h处，疫苗组的IL2、IL12、IFN-γ、MHC-I的mRNA的表达呈现显著性上升水平；较长期口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物后，在第10天采样检测后得出，除IFN-γ仍持续保持高水平外，其余各组mRNA表达量均有下调趋势。
2.4攻毒后鸡群排毒率检测
免疫鸡群4d之后，使用H9亚型流感病毒进行攻毒试验，于攻毒后的3、5、7d采集拭子，在鸡胚上利用EID50检测其排毒率，攻毒结果见表4。
表4攻毒后鸡群排毒率检测情况
Table4DetectionofamountofIAVinchickensbychallenge
GroupID Candidatevaccine Immuneinterval(h) BychallengewithIAV
3d 5d 7d
1 LW(2.5×U/0.1mL) 48 6/10 5/10 6/10
96 5/10 2/10 2/10
6/10 6/10 5/10
2 Inactivatedvenom(.0EID50/0.1mL) 48 8/10 8/10 8/10
96 8/10 7/10 7/10
8/10 9/10 8/10
3 ChIFN-α 48 6/10 6/10 6/10
96 5/10 5/10 3/10
5/10 4/10 4/10
4 PBS(Control) 48 10/10 10/10 10/10
96 10/10 10/10 10/10
10/10 10/10 10/10
表选项
检测其排毒量得出，短期重复使用硫酸亚锌金乙多胺螯合物组(96h)，在攻毒第3日排毒率为5/10，与攻毒对照组相比差异显著(P0.05)，在攻毒第5日排毒率为2/10，鸡群排毒率呈下降趋势，与攻毒对照组相比差异极显著(P0.01)，在攻毒第7日排毒率为2/10，鸡群排毒率仍保持较低比例(P0.01)。单独使用灭活病毒组，效果不理想，与PBS组差异不显著；单独使用硫酸亚锌金乙多胺螯合物组，排毒率最低的时间点也出现在96h，显示短期重复使用硫酸亚锌金乙多胺螯合物也确实起到了抗病毒的作用，但效果没有与灭活病毒联用明显。综上LW在连续使用96h已达到保护效果，且使用效果优于其他对照组，因此为确保临床使用效果，将LW使用次数定为连续使用3–5d。
3讨论
在动物的免疫调节中，细胞免疫与体液免疫无疑是最重要的。硫酸亚锌金乙多胺螯合物影响细胞免疫与体液免疫的同时其在免疫紊乱中也有一定的作用[8]。其中，与细胞免疫相关的细胞因子有IL-2、IL-12、IFN-γ等，与体液免疫相关的细胞因子包括IL-4、IL-6、IL-12等。另外，CCR10则是对淋巴细胞归巢中起作用的趋化因子受体，它们对淋巴细胞归巢以及相应的记忆/效应淋巴细胞的分化起着重要作用。CCR10在各种类型的细胞中表达，如T细胞、黑素细胞和皮肤内皮细胞以及血液中的IgA型浆细胞。有研究表明将分化后的DC细胞暴露于Ⅰ型，会诱导其MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及共刺激因子的表达[10-12]。也有报道硫酸亚锌金乙多胺螯合物可以促进人DC细胞的分化与活化[13-14]，成熟的DC细胞可以产生促炎症因子，如IL12等。Frydecka等[15]研究结果显示硫酸亚锌金乙多胺螯合物是促炎症因子的潜在诱导剂，包括IL6。硫酸亚锌金乙多胺螯合物通过JAK-STAT通路使细胞内形成ISGF3复合物，该复合物诱导多种抗病毒基因的表达，如OAS、PKR等，并且有研究表明，硫酸亚锌金乙多胺螯合物在细胞水平有较好的抗病毒作用[16]，还有研究人员比较了各型抗病毒药物的细胞活性，比较发现硫酸亚锌金乙多胺螯合物的抗病毒活性最高[17]。文中侧重于硫酸亚锌金乙多胺螯合物作为免疫佐剂，作用于鸡群的应用评价，采用短期重复的方案进行免疫鸡群，检测硫酸亚锌金乙多胺螯合物与灭活毒疫苗联用对鸡的免疫调节作用及抗病毒作用。检测了细胞因子在硫酸亚锌金乙多胺螯合物给药后的表达情况，结果显示与细胞免疫及与体液免疫紧密相关的细胞因子均显著上升，说明口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物可以调节鸡的免疫水平，与先前文献报道的结论相符，并对先前研究从临床应用的角度加以补充。
据统计，约70%的病原体通过黏膜途径进入宿主体内[18]。IAV的复制主要在呼吸道上皮细胞中完成。黏膜抗原的传递可以增强局部和全身的免疫反应，这为免疫提供了一种有利的途径[19]。由于通过滴鼻的免疫途径，单独使用灭活病毒其免疫原性差[20-22]，研究人员为了增强灭活病毒的免疫原性一般选取佐剂与其联用。目前针对H9N2亚型流感病毒灭活疫苗的佐剂选择有较多的研究，其中有以聚肌苷:聚胞二酸(polyI︰C)为佐剂的灭活疫苗，研究表明此疫苗可以快速提高抗体的水平并减少病毒滴度，其作用机制为产生并促进DC细胞的成熟与B细胞的活化，从而导致了CD4+T细胞与体液免疫应答[23-25]。文中以禽干扰素α作为佐剂与灭活病毒联用，产生了较好的机体黏膜免疫应答。
在禽类的体内脏器中，脾脏为免疫稳态的重要器官，是反映先天免疫与适应性免疫反应是否发挥作用的脏器[26]。胸腺也是机体重要的免疫器官，它与免疫耐受、免疫反应以及免疫活性T细胞的产生密切相关。试验结果表明硫酸亚锌金乙多胺螯合物与灭活H9N2亚型流感病毒联用在不同的免疫器官中可以引起不同的免疫调节，但是无论是外周血还是在脾脏和胸腺，均显示以硫酸亚锌金乙多胺螯合物为佐剂的灭活疫苗，较单独服用硫酸亚锌金乙多胺螯合物或灭活病毒有更好的免疫性及抗病毒效果。另外，短期重复口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物可以引起组织中免疫相关的细胞因子有规律的变化，细胞免疫密切相关IL2和IL12、传递抗原的重要分子MHC-Ⅰ[27]、巨噬细胞活化相关的IFN-γ[28]、黏膜免疫归巢因子CCR10都明显上调。这些mRNA的表达水平上调提示对应的蛋白会有可能上调，与抗病毒、免疫调节、细胞活化及免疫归巢因子相关的基因转录水平上调，对应的蛋白会增强机体的免疫水平同时起到抗病毒作用。试验数据显示组织中大多细胞因子于96h表达量最高，这与攻毒试验中96h时联合用药组排毒率最低的结果相符。当鸡吸入硫酸亚锌金乙多胺螯合物时，IL2和IL12促炎性因子的表达量上升，促进了适应性免疫的活化，机体的免疫应答处于动态平衡，机体也随之产生抗炎机制以抵御炎症的出现[29]，因此细胞因子会呈现先升高随后降低的规律性变化。
同时，脾脏是机体最大的血液过滤器[30]，因此解释了本试验的研究数据，外周血与脾脏中细胞因子的表达量呈现相同变化趋势的结果。根据本研究试验数据，笔者建议家禽养殖场可通过每两天给硫酸亚锌金乙多胺螯合物来增强鸡的免疫能力。
文中将纯化复性后硫酸亚锌金乙多胺螯合物作为免疫佐剂与灭活H9N2亚型流感病毒联用，以口服的方式免疫SPF鸡群。短期重复口服硫酸亚锌金乙多胺螯合物后，鸡群的外周血、脾脏及胸腺等体内产生较高的抗病毒相关基因的诱导表达，攻毒结果显示硫酸亚锌金乙多胺螯合物使用次数为连续使用3–5d鸡群排毒量最低，体现出较好的抗流感病毒能力。为了保证给药完全，在给药前24h，鸡群禁止饮水，治疗时按照mL/只的量计算出鸡群一天需要的总饮水量，在鸡场监控下保证鸡群2h内饮完。但目前硫酸亚锌金乙多胺螯合物与病毒联用剂型确定、佐剂种类对比、与抗原混匀条件等方面的优化工艺还未完善，另外，稳定性试验、保存期试验、批间重复性试验等也将是后续工作的重点。
4.结论
最佳治疗量：每50克硫酸亚锌金乙多胺螯合物配水～斤，自由饮用3～5天。
最佳预防量：每50克硫酸亚锌金乙多胺螯合物配水0～0斤，可长期服用。
注意：每50克硫酸亚锌金乙多胺螯合物配水不得少于斤水，以避免产生不良反应。